随着类器官的培养及应用日趋火热，对其进行观测、分析与评估的兴趣也日益浓厚。一方面是研究的需要，另一方面也是期待将类器官的制备过程逐步标准化。众多光学显微系统自然在类器官的观测中发挥了重要的作用。ADTE获悉，类器官的光学观测主要是通过对活体或固定的类器官进行成像，可能会涉及到荧光、免疫等标记、透明化处理等步骤。成像后进行二维或三维重构，主要进行两类分析：一类是量化分析。类器官中的细胞种类及其数量，测量特定标记的信号强度等。另一类是进行形态学的观测与分析如类器官的尺寸，如体积、横截面积等。一些常用的类器官光学显微成像系统的应用及其优缺点如下：

1、明场显微镜

明场显微镜可用于观察类器官的形状，主要用于二维参数的测定，如直径、周长和面积。结合Z-Stack测量不同截面，在此基础上进行三维重构，测定类器官的体积。

ADTE获悉，明场显微镜的优势是样品不需要特别的样本制备，无需染色。可以监测类器官的生长，并可用于比较不同控制条件分组类器官的状态。可以在实时的活细胞状态下进行观测。无法进行特定分子的观测与定量分析。对类器官的体积也是有要求的，太大的类器官是无法检测和分析的。

2、荧光显微镜

荧光显微镜使用特定波长的光作为光源激发样品自身或标记的荧光分子使其发出荧光，然后观察其分布、形态等。其优点是可以进行特异性的标记，进而实现分析不同的细胞类型、观测特定点生物分子、基因表达等。普通的荧光显微镜有最佳的聚焦范围，但前景、背景的信号都会对成像产生干扰，降低信噪比。

荧光显微镜光照本身对细胞会有光毒性，对荧光染料也有漂白作用。同样，荧光显微镜对样本的厚度也是有要求的，进而也会限制类器官的三维成像与重构的应用。其分辨率会受到衍射极限的影响，一般在xy平面不超过200-250 nm，在z轴会在500-800 nm。

3、激光扫描共焦显微镜、转盘共聚焦与高内涵系统

激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）通过引入小孔，实现对非共轭焦平面光学信号的排除提升信噪比，并通过层扫来实现相对更厚样本的成像。LSCM在类器官成像有广泛的应用。通常情况下，其成像深度约为100微米左右。也有所谓光调制共聚焦，据说可以实现500微米左右的成像，但其是否会存在伪像等还有待进一步验证。

ADTE获悉，LSCM可以用于测量类器官的亚细胞水平相关参数，如荧光强度、形状、表面积、细胞分布以及用于三维重构等。可以实现细胞的技术、生物标志物、细胞种类与细胞核等的量化分析。健康与疾病类器官的形态比对及分析。可以用于类器官的活性分析并跟踪它们的生长和发育。LSCM中小孔的存在提升了信噪比，但滤过了很多光学信号，需要增加光源的照明强度进行补偿。因此，会增加光漂白和光毒性。

LSCM可以理解为逐点扫描，那成像的效率自然不高。转盘共聚焦是为解决这个问题应运而生的。在转盘上有多个小孔或狭缝，以特定的模式分布。当转盘旋转时，可进行多点同步扫描，相对单一小孔的LSCM，可以显著提升帧率。这类技术的主要缺点是小孔之间的串扰。在类器官方面也有广泛的应用。

高内涵系统可以拆解为转盘共聚焦+数据分析系统+数据存储系统。其在成像方面并没有任何提升，但是在数据分析方面会带来非常多的便利。Molecular Devices的类器官系统就是基于其高内涵系统加入自动化培养等装置进行整合构建的。不过要卖到1000多万，太太太太太贵啊！！

4、多光子显微镜

多光子显微镜（包括双光子显微镜），是建立在LSCM技术基础上，使用长波长的红光或近红外光采集标本高分辨率荧光图像，对活性标本的杀伤极小，尤其适合较厚的组织样本。成像深度可以达到1毫米。支持活体成像，在类器官中也有应用。

5、光片显微镜

光片显微镜的照明方式与传统显微镜有显著区别。这类技术通过形成片层光，使得只有样本中焦平面部分被着凉，从而提升信噪比。通过移动或旋转样品，可以从多个角度对大样品进行成像，以获得完整的三维图像。成像速度有显著提升，适合厚样本拍摄，可以实现数毫米尺寸样本的成像。但产生的数据量巨大，且很多厚样本需要透明化处理。

6、超高分辨率显微镜

超高分辨率显微镜有三种基本技术路线，即单分子定位显微镜 (包括和随机光学重构显微镜（STORM）、光激活定位显微镜（PALM））、受激发射损耗 显微镜 (STED)和结构光照明显微镜SIM。整体而言，超高分辨率显微镜虽然可以揭示亚细胞甚至分子分布，在类器官应用相对较少。

其中STORM适合用于单分子定位与结构解析，STED适合较厚的样本，SIM适合细胞器水平的长时间动态监测。各有优劣，不能完全替代。需要视具体应用场景选择不同技术。

7、光学相干断层扫描 (OCT)

OCT是一种基于激光干涉测量的成像技术，可以提供微米级分辨率和约 1-3 mm 的高穿透深度范围的组织成像。OCT具有非侵入性特性，且成像厚度较高，在类器官方面应用较多。OCT不适合观察内部结构。

ADTE获悉，到目前为止，并没有一种光学显微成像技术可以包打天下，互相不能完全替代，需要组合应用。另外，除高内涵系统外，所有其他技术在应用层面上都在数据处理方面还有很多的挑战，需要在软件、算法以及AI的应用方面去进行整合才能够实现对类器官的应用进行更高效与全面的支持。

文章转载来源：自带光源猛博士

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